Nat Commun︱秦真鹏课题组开发了一种快速超灵敏病毒诊断检测技术：数字等离子体纳米气泡检测

撰文︱叶海航

责编︱王思珍 

单分子计数免疫分析是一种以计数免疫复合体分子个数进行定量免疫分析的技术[1]。这种对分子信号进行逐个计数的方式与信息技术中的数字信号类似，因此单分子计数免疫分析也称为数字免疫分析（digital immunoassay），其主要特征就是单分子检测，检测限可达常规免疫分析技术的1/1000，被认为是下一代免疫技术。目前，该类技术受限于免疫分析操作复杂（例如样品多步洗涤）、检测方式繁琐（需进行样品分区、信号放大等）、成像设备价格高昂等问题，无法在实验室之外的场所进行大范围使用[2-4]。

2022年3月30日，德克萨斯大学达拉斯分校叶海航博士、秦真鹏教授等人在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表了题为“Digital plasmonic nanobubble detection for rapid and ultrasensitive virus diagnostics”的研究文章，展示了一种数字等离子体纳米气泡检测技术（DIAMOND）在病毒诊断中的应用。研究结果表明这种检测技术无需复杂操作，可以在室温下30分钟内检测到单个病毒，检测限与分子检测聚合酶链反应（PCR）类似。此技术为单分子检测技术的发展提供了新的思路。该论文获得Nature Communications编辑的高度认可，被选为编辑亮点文章（Editors' Highlights），以该领域 50 篇最佳论文做重点推介。期刊编辑在评价本项工作中指出“数字免疫分析是一种检测能力极强的平台，但操作复杂。在该工作中，作者展示了基于等离子体纳米气泡流式检测的数字免疫分析技术，通过结合均相免疫分析实现快速和超灵敏的诊断。”

等离子体纳米气泡（plasmonic nanobubble）是指等离子体金纳米等颗粒可以在激光脉冲刺激下，升温蒸发掉粒子表面的一薄层液体，并形成的蒸汽气泡（图1）[5, 6]。这种纳米气泡具有几种特殊性质，例如可以放大纳米颗粒固有的光响应特性，提升颗粒的检测灵敏度和尺寸分辨率，可检测15纳米以下的单个颗粒；同时，纳米气泡具有纳秒级别的短寿命，这种瞬态事件不会产生信号扩散和串扰，因此可以在“虚拟检测区域”进行单分子计数，而无需使用微阵列或微液滴进行物理分区。利用这些性质，该课题组设计了一种光流体检测设备，无需复杂的液相芯片，即可实现等离子体纳米气泡的数字检测。

图1 等离子体纳米气泡（PNB）在流动液相中的产生与检测机制。

(图源：Liu Y, Ye H, et al, Nat Commun, 2022)

为了展示该技术的单颗粒检测能力，作者首先测试了金纳米颗粒悬浮液（图2）。在稀释条件下，纳米颗粒在液相芯片中的流动符合泊松分布，即在虚拟检测体积内（virtual detection zones），各个分区能否分装到纳米颗粒，能分装到几个纳米颗粒属于随机事件；当分区足够多的时候，这种随机概率符合大数定律，并收敛于泊松分布。其典型特征是信号的离散化，分区越多，空白事件（无纳米颗粒）的统计概率越高。检测结果显示，数字等离子体纳米气泡检测技术可对单纳米颗粒进行识别，且检测结果与泊松分布概率具有较好的线性对应关系。

图2 数字等离子体纳米气泡检测技术用于单纳米颗粒检测原理和检测结果。

(图源：Liu Y, Ye H, et al, Nat Commun, 2022)

随后，作者结合均相免疫分析实现了对单个病毒颗粒的快速、便捷检测（图3）。作者首先制备了一种抗体修饰的金纳米探针，可以特异性的识别呼吸道合胞病毒（RSV），并富集在病毒颗粒表面。其次，对免疫孵育后的样品进行检测，无需洗涤等操作，可在两分钟内获得检测结果，并且检测限达~100 PFU/mL。利用数字环介导等温扩增技术进行交叉验证，作者证明了数字等离子体纳米气泡检测技术的灵敏度与核酸扩增技术接近，达单RNA拷贝每微升。然而，数字等离子体纳米气泡检测技术无需病毒RNA提取等操作，有利于测试操作简化。对纳米探针进一步优化，作者对复杂样品中的RSV病毒颗粒同样实现了高特异性、高灵敏的检测。

图3 数字等离子体纳米气泡检测技术用于单病毒颗粒检测原理和检测结果。

(图源：Liu Y, Ye H, et al, Nat Commun, 2022)

文章结论与讨论，启发与展望

综上，本研究首次提出了一种数字等离子体纳米气泡检测技术，并实现了单病毒颗粒的超灵敏检测，且无需复杂操作，检测快速。目前，该技术只对病毒等大生物颗粒进行了检测，且对脉冲激光的能力要求较高。为解决这些问题，作者对本项技术的未来发展做了详细的谈论，例如通过结合先进液相芯片和微型化激光，可以对床旁即时检测设备的开发进行研究；集成高速脉冲激光和数字信号分析技术，有望实现对蛋白等小分子生物标志物进行数字免疫分析。此技术有望打破数字免疫分析商用平台设备价格高昂、需专业人员操作等局限，并为疾病的早筛早诊提供新的检测平台。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29025-w

编辑亮点文章链接：https://www.nature.com/collections/bjiiabbacg

本文由德克萨斯大学达拉斯分校博士研究生刘雅宁和博士后叶海航担任共同第一作者，叶海航博士和秦真鹏教授为共同通讯作者，西南医学研究中心为论文工作提供病毒等样品。论文工作得到美国国立卫生院等基金支持。 

文章主要作者合影：秦真鹏教授（左），刘雅宁（中），叶海航博士（右）

（照片提供自：德克萨斯大学达拉斯分校秦真鹏实验室）

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通讯作者简介（上下滑动阅读）

叶海航博士现于德克萨斯大学达拉斯分校任博士后。致力于研究纳米颗粒的可控合成及其光催化、生物传感等应用，在Nat Commun、Nano Lett、ACS Nano、Small等国际知名期刊上以第一作者或通讯作者身份发表研究论文15篇，应邀担任国际学术会议“激光和光电会议CLEO 2021”分会场主持，担任期刊《Biosensors》、《Frontiers in Chemistry》的特刊客座编辑。

秦真鹏教授现于德克萨斯大学达拉斯分校任副教授（课题组网页https://www.nanobrainlab.net/）。重点研究方向为基于对大脑和诊断系统的生物运输问题的理解，开发以纳米技术为主体的诊疗工具以更好地了解大脑血管屏障疾病并彻底改变即时传染病诊断技术。在Chem Soc Rev、Nat Commun、Angew Chem Int Ed、J Am Chem Soc、Nano Lett、ACS Nano等国际知名期刊上以通讯作者或第一作者身份发表研究论文20余篇，获得多项授权专利，并应邀担任多个国际学术会议主持等。

课题组研究领域与兴趣：

· 分子热疗研究。

· 神经调节的解锁技术。

· 血脑屏障的调制技术。

· 传染病的即时诊断研究。

欢迎有志于课题组相关领域研究的博士后和研究生加盟，联系邮箱：[e-mail]。

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参考文献（上下滑动查看）  

1. Basu, S. A. Digital Assays, Part I & II, SLAS Technol. 22, 387-405 (2017).

2. Rissin, D. M. et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595–599 (2010).

3. Yelleswarapu, V. et al. Mobile platform for rapid sub-picogram-per-milliliter, multiplexed, digital droplet detection of proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 4489–4495 (2019).

4. Akama, K. & Noji, H. Multiplexed homogeneous digital immunoassay based on single-particle motion analysis. Lab Chip 20, 2113–2121 (2020).

5. Lukianova-Hleb, E. Y. et al. On-demand intracellular amplification of chemoradiation with cancer-specific plasmonic nanobubbles. Nat. Med. 20, 778–784 (2014).

6. Lukianova-Hleb, E. Y. et al. Intraoperative diagnostics and elimination of residual microtumours with plasmonic nanobubbles. Nat. Nanotechnol. 11, 525–532 (2016).

制版︱王思珍

本文完